Depuis 1306, Orléans est dotée d’une université connue dans toute l’Europe. Depuis le XIV^e siècle, l’université d’Orléans s’impose avec Bologne comme la principale université de droit romain en Europe. Les thèses de Luther s’y diffusent grâce à des enseignants comme Melchior Wolmar. Jean Calvin, étudiant en droit romain à Orléans en 1528, à 19 ans pour y suivre les cours de Pierre de l’Estoile, y découvre la Réforme. La Réforme s’installe dans une cité catholique, royaliste et marquée par sa libération en 1429 par Jeanne d’Arc.

Au milieu du 16ème siècle, Orléans est considérée comme l’un des berceaux du protestantisme. Surnommée «Nouvelle Genève», la ville accueille en 1562 le troisième synode national et Condé fait d’Orléans le quartier général des protestants. En 1563, François de Guise assiège la ville avec vingt mille hommes, lorsqu’il est assassiné. De 1568 à 1572, Orléans est le front de la reconquête catholique. La ville compte un millier de victimes lors de la Saint-Barthélemy. Orléans ne se soumet qu’en 1594 à Henri IV, venu l’assiéger en personne.