Seit 1306 besitzt Orléans eine in ganz Europa bekannte Universität. Zusammen mit Bologna hat sich die Universität Orléans seit dem 14. Jahrhundert zu einer der bedeutendsten Universitäten für römisches Recht in Europa entwickelt. Dank Dozierenden wie Melchior Wolmar verbreiteten sich hier Luthers Thesen. Jean Calvin, der 1528 19-jährig in Orléans römisches Recht studierte und die Vorlesungen von Pierre de l’Estoile besuchte, hat hier die Reformation entdeckt. Die Reformation hielt Einzug in eine ursprünglich katholische und royalistische Stadt, die von ihrer Befreiung im Jahr 1429 durch Jeanne d’Arc geprägt war.

Mitte des 16. Jahrhunderts galt Orléans als eine der Geburtsstätten des Protestantismus. Die als „Neues Genf“ bezeichnete Stadt war 1562 Gastgeber der dritten Nationalsynode. Condé machte Orléans zum Hauptquartier der Protestanten. Im Jahre 1563 belagerte François de Guise die Stadt mit zwanzigtausend Mann, wurde dabei aber ermordet. Von 1568 bis 1572 befand sich Orléans an der Kriegsfront der katholischen Rückeroberung. Die Stadt zählte während der Bartholomäusnacht rund 1.000 Opfer. Orléans unterwarf sich erst 1594 Heinrich IV., der die Stadt persönlich belagerte.